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琼脂糖凝胶电泳步骤

发布时间:2018/6/21

    文章关键词:琼脂糖,琼脂,凝胶电泳,步骤

 

    电泳中有一种利用琼脂糖作为介质的方法,称为琼脂糖凝胶电泳。它的分析原理与其他支持物电泳有一些区别,主要表现在它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。那琼脂糖凝胶电泳的步骤是什么呢?下面青德慧海洋生物为您介绍一下。

 

    一、试剂配制

    5×TBE缓冲液:450 mmol/L Tris-硼酸,10 mmol/L EDTA,pH值8.0。在使用时,先将上述储存液稀释10倍,达到0.5×TBE缓冲液后,就能同时作为电泳和制胶用的缓冲液。


    二、制胶


    1.  根椐需要的制胶量和凝胶浓度,在已有电泳缓冲液的三角锥瓶中,投入准确称量的琼脂糖粉(总液体量保持不超过锥瓶的50%容量)。琼脂糖粉末和0.5×TBE buffer的比例(w:v)参考下表,常用琼脂糖浓度为0.7-1%。

 

 琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围

琼脂糖浓度

最佳线形DNA分辨范围(bp)

0.50%

 1 000~30 000

0.7%  

800~12 000

1%

500~10 000

1.20%

400~7 000

1.50%

200~3 000

2%

50~2 000

2%~5%

20~1 000

 



    2.  将保鲜膜或牛皮纸覆盖在锥瓶的瓶口,并使用牙签或细针在覆纸上扎些小孔,然后放入微波炉,将琼脂糖加热溶解。当溶液加热至沸腾后,需要摇动锥瓶,使琼脂糖充分且均匀溶解。操作这一步时,注意戴上防热手套,以防烫伤。多次摇晃,直到琼脂糖完全溶解。

    3.  常温放置,在溶液冷却至50℃-60℃左右时,根据需要决定是否加入溴化乙锭溶液(终浓度0.5  μg/ml)或按照1 μL / 30 mL的比例加入DNAgreen染料,并且充分混匀。


    4.  将琼脂糖溶液倒入制胶模具中,挑选适当位置,插入梳子,凝胶厚度保持在3~5 mm之间。制胶模如下图所示,小胶倒入25-30 mL上下琼脂糖溶液,大胶则60-70 mL上下,如果需切胶回收,凝胶可以选择适当加厚。

    5.  在室温下使胶凝固,大约需要30——60分钟。

 


    三、上样


    1.  取合适份量的样品与6×上样缓冲液混匀(如:1 μl样品与5 μl 6×上样缓冲液),用微量移液枪谨慎加入样品槽中。


    2.  上样量可以根据样品的浓度适当调整范围,如果DNA含量较低,可以按照上面说的比例增加上样量,但是总体积不能超过样品槽容量(一般小孔40 μl 为上限,大孔200 μl 为上限,具体与制胶膜规格相关)。

 

    3.  注意,每一个样品都要使用不同枪头,以防止发生污染,注意上样时要谨慎操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

    四、电泳

    1.  加样完成后,合上电泳槽盖并立即接通电源。电压控制在110 V,电流在40 mA以上。

    2.  当条带移动到距凝胶前沿约2厘米时(约40分钟),停止电泳。

    3.  紫外线照射下拍照并观察。

 

    以上就是琼脂糖凝胶电泳的详细步骤,大家按照步骤,就可顺利实现操作,达成实验目的。

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